应用FRR叶绿素荧光诱导技术估算有效光反应中心含量

      PSII可与PSI协同从水中获取电子生成还原体、驱动光化学反应和植物营养循环。因此有效PSII光反应中心（[PSII]active）的含量可作为植物生产力评估的基础因子，同时也是评估植物光合速率、研究植物胁迫响应的关键。而对于液体样品，[PSII]active含量同样是评估水生生物光合作用速率以及分析浮游植物对胁迫的响应的关键参数。但传统上缺少稳定、可靠、快速的 [PSII]active含量的测量方法。

      传统上对于[PSII]active的测量：

• 免疫印迹法测定PSII蛋白复合体的丰度：

        不能说明其中能够贡献于持续电子传递的、光化学有效的PSII蛋白复合体的含量。

• 放氧法对[PSII]active含量值进行测量：

        耗时长：每个样品要测量大概15 min；不准确；需要浓缩悬浮物样品至很高的浓度，才能检测到明显的参数变化。同时，在测量过程中，氧气的消耗及其多种代谢途径会影响测量结果。因此不适合测量培养物的动态生理变化，更不适合测量持续变化环境中的自然种群。因而无论对于实验室研究还是野外实验，很多情况下都不适用。

      本文将介绍加拿大蒙特爱立森大学的Campbell教授的研究------应用FRR叶绿素荧光诱导技术进行[PSII]active含量估算的方法。该方法有效解决了传统测量方法存在的问题。其原理是：在一定体积下：

a）F’_o强度与[PSII]active色素含量相关；

b）σ’_PSII与PSII色素总含量相关。

        因此，F’_o/σ’_PSII可以代表单位体积的[PSII]active含量。(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)。而这两个参数都可以利用快速饱和及弛豫荧光诱导程序（fast repletion and relaxation (FRR) fluorescence induction）获得。（注：σ’_PSII: 光适应状态下PSII的有效吸收截面；F’_o：光适应下的基础荧光。）

        为了证明该方法用于估算[PSII]active含量可靠、可行，即受非光化荧光淬灭影响很小、测量快速并且稳定、具有时间分辨性、可应用于对湖泊和海洋水体的初级生产力的快速评估，该研究进行了209次成对测定，对不同培养和处理条件下的海洋蓝藻、分别在高光和低光处理下的原生态型球藻、北极和温带的绿藻、两种中心硅藻进行测试。

        由于藻类的生理状态对培养密度、光照条件、气体状态、温度、pH值等都很敏感，进而直接影响所得参数和公式的科学性，所以需要精确控制培养条件并实时监测培养状态。因此本研究使用FMT150光养生物反应器对中心硅藻两个藻株分别在2种不同状态下进行培养和监测，精确控制营养浓度、温度、光照，并自动进行恒化培养。在培养过程中仪器自动使用水蒸气饱和的空气气泡混匀，避免沉降。（FMT150光养生物反应器介绍见后附）

        之后使用FL3500（当前升级为FL6000）测量每个样品的F’_o和σ’_PSII，用以计算[PSII]active。FL3500可自动控制和测量样品温度、预施光照、光化光、单周转饱和光闪、Q_A再氧化等8种默认测量程序、精确自定义程序等。

        同时使用荧光光纤氧气传感器测量密闭比色皿里样品的溶氧浓度。氧气的测量可由仪器自带软件程序自动控制。

        放氧测量过程如下图所示：在FRR测量过程中，氧气浓度随激发光变化并与时间（横轴）相对应。将氧探头固定在FL3500自动控温探头上，一同插入FL3500测量单元内的待测样品中。FL3500具有磁力搅拌功能，该功能可由触控面板控制，也可由FL3500自带软件FluorWin程序精确定义。

         在初始300s的暗适应过程中记录氧气浓度作为暗呼吸值；之后用低光（20 µmol.m^-2.s^-1）进行预光照激活光系统并测量氧气；在一个FRR程序结束后立刻测量氧气浓度作为在FRR过程中的呼吸。二者差值用于估算样品中[PSII]active含量。

        之后将样品置于光下300 s；再次进行FRR诱导（见下图）并测量氧浓度。再次估算样品中[PSII]active含量。公式为：

μmol PSII L-1=μmol O2s-1L-1×（25.025×10-3s Flash-1）×(4 Flash 1×1 PSII/O2)

        FRR测量过程如下图所示：先进行300 μs的暗适应。预光照之后使用40个（间隔2 μs）单周转光闪（1.2 μs， 65000 µmol.m^-2.s^-1）的激发序列进行FRR诱导，以逐渐关闭全部PSII；在这个过程中得到F_o、F_M、σ_PSII、ρ（表示PSII 光反应中心的连通性）。之后降低光闪重复速率，PSII逐渐打开，此过程持续0.25 s。黑暗2 s，PSII打开。再施加第二次FRR诱导，得到F’_o2、F’_M2s、σ’_PSII2s……

        使用放氧法得到的[PSII]active对FRR得到的 [PSII]active=F’_o/σ’_PSII 公式进行校正，得到校正参数。

        本研究验证了前人(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)的假设，应用FRR测量得到的[PSII]active矫正公式适用于本文所述所有藻类样品，包括：呈指数增长的样品、短期生理波动的非稳态样品、光抑制样品、低浓度样品、光适应下的样品，并且受非光化荧光淬灭影响很小。

         因此可以用FRR测量程序来估算湖泊和海洋不断变化的环境中的初级生产力。

        本案例文献： Murphy C. D., Ni G., Li G., et al. (2016) Quantitating active photosystem II reaction center content from fluorescence induction transients. Limnol. Oceanogr. Methods. DOI:10.1002/lom3.10142

1. 本研究应用的FMT150藻类培养与在线监测系统: 详见北京易科泰生态技术有限公司网站

        FMT150 光氧生物反应器为捷克PSI公司生产，北京易科泰生态技术有限公司为PSI公司在中国的*家代理。FMT150容量分为400ml、1000ml、3000ml。另有订制大型版。

        FMT150将生物反应器与监测仪器*地结合在一起，用于淡水、海水藻类和蓝细菌（蓝藻）等的模块化精确光照培养与生理监测。

ü 控制单元：包括电脑与预装软件。用户自定义程序自动改变培养条件并实时在线监测培养条件与测量参数。光强、光质、温度和通入气体的组分与流速都可以精确调控。恒浊和恒化控制模块用于自动调控培养基的pH值和浊度。控制单元可同时控制多台FMT150进行同步实验，保证不同处理实验间的一致性。

ü 监测单元：包括溶氧、CO₂、pH、培养光强、温度、OD 680、OD 720、以及叶绿素荧光参数Ft、Fo、Fm、Fm′和QY。

2. 本研究应用的氧气实时测量解决方案请咨询北京易科泰生态技术有限公司：

3. 本研究中FRR（该功能须提前订制）测量仪器：FL3500 （当前已升级为FL6000）:

详细见北京易科泰生态技术有限公司易科泰网站

        FL6000 双调制叶绿素荧光仪为捷克PSI公司生产，北京易科泰生态技术有限公司为PSI公司在中国的*家代理。有标准版和快速版。本研究应用的FRR测量程序为快速版提供。

        具备双通道测量控制，一个通道用于对蓝绿藻或绿藻等微藻，叶绿体或类囊体悬浮物、叶片碎片进行叶绿素荧光测量；另一个可选择使用：测量和控制样品温度或者氧气。此外可选配远红光源（735 nm）、磁力搅拌等功能。

        FL6000的测量单元提供毫秒级低强度测量光闪、超短单周转光、以及持续光化光，三者的强度和持续时间全部可通过软件实现非周期的精确编程控制。检测器为500 kHz/16位 AD 转换的PIN二极管信号检测器，测量叶绿素荧光信号的时间分辨率可高达4 µs（快速版为1µs）。AD转换的增益和积分时间同样可以通过软件精确控制。

        内置测量程序如下：

        应用领域：光合自养生物悬浮物生理研究、PSII光化学效率测量、水体初级生产力估算、浮游植物的光合作用和代谢扰动、藻华研究、藻类抗胁迫能力或者易感性研究、光合系统工作机理研究、受胁迫植物光合生理应对策略研究等。

        北京易科泰生态技术有限公司是由科学家创建并为科学家提供科技服务的新技术企业，是PSI公司在中国的*家代理和技术咨询服务中心。易科泰生态技术公司在青岛、西安设有分公司，在全国各地设有办事处，北京总部设立有 EcoLab 实验室以提供实验研究合作、仪器技术培训等。