热释光技术快速检测植物脂质过氧化

由高温、低温、干旱、重金属以及病虫害引起的植物胁迫，导致每年农作物的产量降低，品质下降。各类胁迫都会导致活性氧（ROS）的累积。当植物细胞的细胞膜或者细胞器膜的磷脂分子受到ROS攻击之后，便会发生脂质过氧化反应，形成脂质过氧化产物。脂质过氧化使细胞膜的流动性和通透性发生改变，最终导致细胞结构和功能的改变。

目前，脂质过氧化通常通过测定降解产物（如丙二醛MDA）含量或检测抗氧化剂活性进行评估，前者可采用荧光法或TBA法，后者往往采用高效液相色谱法或紫外可见光分光光度法。这些检测方法各有优缺点，如TBA-MDA法设备要求低，但灵敏度差；高效液相色谱法仪器定量明确，但仪器昂贵、操作繁琐。

本文介绍一种快速简单的检测方法。该方法基于植物热释光技术。通过测定的TL曲线的特征波峰快速检测植物的氧化胁迫，测定脂质过氧化水平。

晶体受到辐射照射后，会产生自由电子，这些电子被晶格缺陷俘获而积攒起来，在加热过程中以光的形式释放出来。这种现象即为热释光（英文名称Thermoluminescence，缩写为TL）。

热释光测定基本的实验过程是将叶片或藻液快速冷冻到某一温度，之后给叶片一个足够强，但时间尽量短（一般<5µs）的单反转光（single turn-over flash），用于诱导热释光；然后逐渐升温，同时测量样品放出的热释光，绘制TL谱带。

目前商业化的植物热释光测量系统为TL6000。北京易科泰生态技术有限公司提供TL6000完备的系统配置及专业的售后服务。

 大量研究发现：热释光测量能够反映光合生物的脂质过氧化水平。热释光强度会在120℃至140℃升温过程产生特异性波峰。该波峰代表由三重态羰基及单线态氧引起的脂质过氧化的水平，即波峰越高脂质过氧化程度越高，并且波峰高低与其他脂质过氧化检测指标存在相关关系。如下图，热释光特征峰强度与MDA浓度呈现较强的线性相关性（黑色实心方形），引自1998年的《Photochemistry and Photobiology》，原文题目为《The Origin of 115-130°C Thermoluminescence Bands in Chlorophyll-Containing Material》。

 该特征波峰在20世纪90年代被发现后，便广泛用于各类胁迫研究中。如2003年，《PNAS》刊登了题为《Early light-induced proteins protect Arabidopsis from photooxidative stress》的论文：Claire等人使用了植物热释光技术，评估了高光下低温胁迫对野生型和突变体的氧化损伤。相比于野生型，高光环境低温胁迫下的chaos突变体（叶绿体蛋白转运相关元件cpSRP亚基缺失）遭受了严重的光氧化损伤，即135℃左右的热释光信号强烈，并表现为叶片褪绿。 

Renata等人使用Thermoluminescence TL 系统研究了新型污染物纳米二氧化钛TiO2对拟南芥生长和抗氧化物含量及基因表达、抗氧化酶活性等方面的影响，发现高浓度TiO2处理拟南芥种子造成了成熟个体叶片的脂质过氧化。论文发表于2016年《Environmental Pollution》杂志，题为《Titanium dioxide nanoparticles (100-1000 mg/l) can affect vitamin E response in Arabidopsis thaliana》。

中科院水生生物研究所王强课题组对比了常温和低温环境下极地雪藻和模式藻莱茵衣藻的生长、光合活性、膜脂质过氧化、抗氧化活性，揭示了极地雪藻低温适应的光合调节基础。脂质过氧化的评估除了测定了MDA的含量，还使用Thermoluminescence TL系统考察了脂质过氧化水平。结果显示低温下莱茵衣藻表现出*的脂质过氧化水平，而极地雪藻却没有显著升高，表明极地雪藻在低温环境中能够有效清除活性氧。该特性可能是极地雪藻适应低温的原因之一。论文发表于2020年的《Frontiers in Microbiology》杂志，题为《Low-Temperature Adaptation of the Snow Alga Chlamydomonas nivalis Is Associated With the Photosynthetic System Regulatory Process》。

由此可见，基于Thermoluminescence TL 系统的脂质过氧化检测能够快速、轻松、有效检测植物的氧化胁迫，测定脂质过氧化水平。本文提到的各类脂质过氧化检测方法采用了不同的手段，也反映了不同的侧面。研究者可根据研究目的和实验条件选择不同的检测方法或同时选择几种方法对植物的脂质过氧化进行全面评估。

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• TL热释光技术测定植物脂质过氧化的部分论文有：

1. Bacsó, R., Molnár, A., Papp, I., and Janda, T. (2008). Photosynthetic behaviour of Arabidopsis plants with a Cap Binding Protein 20 mutation under water stress. Photosynthetica 46, 268.
2. Ducruet, J.-M. (2003). Chlorophyll thermoluminescence of leaf discs: simple instruments and progress in signal interpretation open the way to new ecophysiological indicators. Journal of Experimental Botany 54, 2419–2430.
3. Havaux, M., and Niyogi, K.K. (1999). The violaxanthin cycle protects plants from photooxidative damage by more than one mechanism. PNAS 96, 8762–8767.
4. Havaux, M., Bonfils, J.-P., Lütz, C., and Niyogi, K.K. (2000). Photodamage of the Photosynthetic Apparatus and Its Dependence on the Leaf Developmental Stage in the npq1 Arabidopsis Mutant Deficient in the Xanthophyll Cycle Enzyme Violaxanthin De-epoxidase. Plant Physiology 124, 273–284.
5. Hutin, C., Nussaume, L., Moise, N., Moya, I., Kloppstech, K., and Havaux, M. (2003). Early light-induced proteins protect Arabidopsis from photooxidative stress. PNAS 100, 4921–4926.
6. Merzlyak, M.N., Pavlov, V.K., and Zhigalova, T.V. (1992). Effect of Desiccation on Chlorophyll High Temperature Chemiluminescence in Acer platanoides L. and Aesculus hippocastanum L. Leaves. Journal of Plant Physiology 139, 629–631.
7. M’rah, S., Ouerghi, Z., Berthomieu, C., Havaux, M., Jungas, C., Hajji, M., Grignon, C., and Lachaâl, M. (2006). Effects of NaCl on the growth, ion accumulation and photosynthetic parameters of Thellungiella halophila. Journal of Plant Physiology 163, 1022–1031.
8. Szymańska, R., Kołodziej, K., Ślesak, I., Zimak-Piekarczyk, P., Orzechowska, A., Gabruk, M., Żądło, A., Habina, I., Knap, W., Burda, K., et al. (2016). Titanium dioxide nanoparticles (100–1000 mg/l) can affect vitamin E response in Arabidopsis thaliana. Environmental Pollution 213, 957–965.
9. Vavilin, D.V., and Ducruet, J.-M. (1998). The Origin of115–130°C Thermoluminescence Bands in Chlorophyll-Containing Material. Photochemistry and Photobiology 68, 191–198.
10. Zheng, Y., Xue, C., Chen, H., He, C., and Wang, Q. (2020). Low-Temperature Adaptation of the Snow Alga Chlamydomonas nivalis Is Associated With the Photosynthetic System Regulatory Process. Front. Microbiol. 11.